普通兔疫熒光(單標(biāo))
1.切片脫蠟:將石蠟切片依次放入二甲苯I ( 10min)-二甲苯I ( 10min) -無(wú)水Z醇I ( 5min) -無(wú)水乙醇I ( 5min ) -95%酒精( 3min ) -90%酒精( 3min ) -80%酒精( 2min ) -70%酒精( 2min ) , 然后蒸餾水浸洗2min.
2、抗原修復(fù):我們采用微波進(jìn)行抗原修復(fù)，將脫蠟水化后的組織切片置于燒杯(或修復(fù)盒)中的不銹鋼(或耐高溫塑料)切片架上,加適量的修復(fù)液( 0.01M枸櫞酸緩沖液, pH6.0 )于燒杯中,液面要浸過(guò)切片組織一定高度,微波爐可先用高檔加熱使液體沸騰,當(dāng)加熱至沸騰時(shí)調(diào)到中檔,此時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí),修復(fù)時(shí)間為10-15min ,此過(guò)程中勿使組織干片(修復(fù)液要足量)。到時(shí)間后將燒杯從微波爐中取出,放入冷水中冷卻降溫,當(dāng)修復(fù)液降至室溫后取出玻片,用PBS ( PH7.4)沖洗3遍,每次3min (沖洗過(guò)程中切勿對(duì)著組織沖洗,以免弄破組織)。
3、血清封閉:用吸水紙擦干玻片,免疫組畫(huà)筆在組織周?chē)?huà)器,滴加稀釋好的正常山羊血清，室溫封閉30min ,以減少非特異性染色。
4.加一抗:甩去多余液體,不洗,然后滴加稀釋好的一抗,如果做陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。就在對(duì)照組的切片上滴加PBS。加完一抗后于4°C濕盒中孵育過(guò)夜。
5.加熒光二抗: PBST沖洗切片3次,每次3min ,吸水紙擦干切片后滴加稀釋好的熒光=抗,濕盒中20-37°C孵育1h，PBST沖洗切片4次，每次3min.
注意:此步驟及后面所有操作步驟都盡量在暗處進(jìn)行。
6、復(fù)染核:滴加DAPI避光孵育5min。對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核。PBST 5minx4次洗去多余的DAPI。
7.封片鏡檢:用吸水紙擦干切片上的液體,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。