骨組織切片及trap染色實驗步驟

1、 骨組織脫鈣:新鮮骨組織固定于4%多聚jia醛24h以上，將組織從固定液取出置于EDTA脫鈣液內(nèi)脫鈣(不能用含酸的脫鈣液脫鈣)，每3天換一次脫鈣液，至骨組織針扎可以順利通過為止。

2、 取材:在通風(fēng)櫥內(nèi)用**刀將目的部位組織修平整，將修切好的組織和對應(yīng)的標(biāo)簽放于脫水盒內(nèi)。

3、 脫水:將脫水盒放進吊籃里于脫水機內(nèi)依次梯度酒精進行脫水。75%酒精4h-85%酒精2h-90%酒精2h-95%酒精1h-無水醇 30min-無水/醇ll30min-醇苯5-10min-二甲苯|5-10min-二甲苯ll5-10min-蠟| 1h-蠟|| 1h-蠟Il1h.

4、 包埋:將浸好蠟的組織于包埋*內(nèi)進行包埋。先將融化的蠟放入包埋框，待蠟?zāi)讨皩⒔M織從脫水盒內(nèi)取出按照包埋面的要求放入包埋框并貼上對應(yīng)的標(biāo)簽。于-20°凍臺冷卻，蠟?zāi)毯髮⑾瀴K從包埋框中取出并修整蠟塊。

5、 切片:將修整好的蠟塊置于石蠟切片機上切片，片厚4um。 切片漂浮于攤片機40℃ 溫水上將組織展平，用載玻片將組只撈起，并放進60°℃烘箱內(nèi)烤片，待水烤干蠟烤化后取出常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

6、石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯I20min二甲苯Ⅱ20min-無水乙醇I10min-無水乙醇Ⅱ10min-95%酒精

5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸餾水洗。

7、染液配制:A液:0.1mol/L醋酸緩沖液PH5.0:醋酸Na1.3608q+蒸餾水100ml溶解，用Bing醋酸調(diào)PH值到5.0。B液:六偶氨副品紅 4%業(yè)肖酸Na:2g亞當(dāng)酸Na+去離子水50ml副品紅溶液:副品紅2.5q+去離子水50ml+濃鹽酸7.5ml，加熱至90°溶解后過濾，4°棕色瓶保存。臨用前4%亞肖酸Na與副品紅溶液等比例混合。C液:萘酚AS-Bl磷酸酯20mg+N.N-2甲基甲酰胺1ml溶解。孵育液配制:A液18ml+B液1ml+C液1ml混勻，用1MNaOH或1M鹽酸調(diào)pH至5.0，再加酒石酸鉀Na0.282q，充分溶解過濾后備用即為TRAP孵育液。

8、 染色;切片詈干TRAP孵育液內(nèi)37°孵育50min，鏡下觀察破骨細胞呈灑紅色為止，蒸餾水酒洗。

9、蘇木素染細胞核:切片入Harris蘇木素染3-8min，自來水洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗，0.6%氨,水返藍，流水沖洗。

10、脫水封片:將切片依次放入95%酒精l5min-95%酒精l5min-無水/醇I5min-無水/醇T5min-甲苯15min-單

苯Ⅱ5min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。

11、 顯微鏡鏡檢，冬像采集分析。

染色結(jié)果:破骨細胞胞漿呈酒紅色，核藍色。